Национальная ассоциация ученых (НАУ) # 56, 20 20 5
5
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НА УКИ
ИССЛЕДОВАНИЕ ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ ПОСЛЕ ИНДУКЦИИ
ЛИМФОПЕН ИИ ЦИКЛОФОСФАНОМ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ НА МЫШАХ
Гринько Екатерина Константиновна
Студентка
Московская государственная академия ветеринарной
медицины и биотехнологии -МВА имени К. И. Скрябина
г. Москва
Марзанова Саида Нурбиевна
Кандидат биологических наук, доцент
Московская государственная академия ветеринарной
медицины и биотехнологии -МВА имени К. И. Скрябина
г. Москва
Донецкова Альмира Дмитриевна
Доктор медицинских наук, ведущий на учный сотрудник, доцент
“Государственный научный центр “Институт имму нологии”
Феде рального медико -биологического агентства,
Российский национальный исследовательский
медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России
г. Москва
RESEARCH OF RESTORAT ION PROCESSES AFTER INDUCTION OF LYMPHOPENIA BY
CYCLOPHOSPHANE IN AN EXPERIMENTAL MODEL ON MOUSE
Grinko Ekaterina
Student
Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education
“Moscow State Academy of Veterinary
Medicine and Biotechnology - MVA named after K.I. Skryabin”, Moscow
Marzanova Saida
Candidate of S cience, assistant professor
Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education
“Moscow State Academy of Veterinary
Medicine and Biotechnology - MVA named after K.I. Skrya bin”, Moscow
Donetskova Almira
Doctor of Science, assistant professor
National Research Center – Institute of Immunology Federal
Medical -Biological Agency of Russia,
Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow
DOI: 10.31618/nas.2413 -5291.2020.2.56.249
Аннотация
Цель работы: оцен ка динамики восст ановления Т -клеток после воздействия циклофосфана (Ц Ф). ЦФ
вводилив дозе 125 мг/кг с последующим забоем мышей на 0, 10, 20, 30, 60 сутки и определением
субпопуляционного состава методом проточной цитометрии. Показано, что тимоциты более уя звимы к
действию препарата, чем лимфоциты селезенки. В осстановительны е процессы в ти мусе начинаются
раньше с последующим медленным восстановлением лимфоцитов селезенки. В результате действия ЦФ
происходит усиление феномена конверсии фенотипа наивных Т -клет ок в центральные Т -клетки памяти с
относительным накоп лением последни х.
Abstract
Objective: to evaluate the dynamics of T -cell recovery after exposure to cyclophosphamide (CP). CP was
injected at a dose of 125 mg/kg, followed by killing of mice on days 0, 10, 20, 30, 60 and determination of the
subpopulation composition by flow cytometry. It was shown that thymocytes are more vulnerable to the action of
the CP than spleen lymphocytes. Cell restoration in the thymus begins earlier with delayed recovery of sp leen
lymphocytes. Due to CP, there is an increase in t he conversion o f the naive T -cells into central memory T -cells
with a relative accumulation of the latter.
Ключевые слова: циклофосфан; Т -лимфоциты; наивные Т -клетки; центральные Т -клетки памяти;
конверсия фенотипа; проточная цитофлуориметрия.
Keywords: cyclophosphamide; T -lymphocytes; naïve T cells; central memory T cells; conversion of the
phenotype; flow cyt ometry.
6 Национальная ассоциация учены х (НАУ) # 56, 20 20
В течение жизни иммунная система
подвергается воздействию различных факторов,
которые могут вызывать ее угнетен ие [1, с. 18]. При
прекращении действия повреждающего фактора
обычно происходит восстановление иммунной
системы. В организме существует механизмы
восстановления численности лимфоцитов, в
частности Т -клеток: тимопоэзи гомеостатическая
пролиферация [5, с. 38 5-386].
Химиотерапевтические препараты, которые
применяют в медицине, являются одним из
факторов, вызывающих иммуносупрессию [2, с.
24 ]. Алкилирующие химиотерапевтические
препараты повреждают генетический аппарат
активно делящихся клеток, уменьшают количе ство
иммунокомпетентных клеток в первичных и
вторичных лимфоидных органах [3, с. 134].
Циклофосфамид, или циклофосфан – один из
распрост раненных препаратов из группы
алкилирующих агентов, который активно
применятся в настоящее время.
Препарат имеет сложные пути превращения с
участием НАДФ и оксидаз (цитохрома Р450),
алкогольдегидрогеназы и адьдегиддегидрогеназы,
в результате которых циклоф осфан превращается в
цитотоксичный фосфорамидный мустард и
акролеин [4, с. 16 -18][6, с. 731].
После воздействия цитостат ика число Т -
клеток восстанавливается за счет усиления
тимопоэза в тимусе и за счет гомеостатической
пролиферации в периферических лимфо идных
органах. Оценка вклада каждого из этих
механизмов в регенерацию Т -клеточного звена
иммунной системы имеет важное зн ачение как для
понимания патогенеза этих состояний, так и для
поиска адекватных методов их коррекции.
Цель исследования: оценить динами ку
восстановления Т -лимфоцитов по сле воздействия
циклофосфана на мышах линии C57 BL /6.
Материалы и методы.
Исследованиепро водилось на мышах линии
C57 BL /6, самках в возрасте 6 -8 недель, полученных
из питомника «Столбовая» ФГБУН НЦБМТ ФМБА
России(Москва). Мыш и с одержались в
контролируемых условиях: температура
окружающего воздуха 22±2 оС; относительная
влажность 65±5%. Доступ к воде и корму был
свободным, световой режим естественным.
Животные были разделены на 2 группы:
экспериментальной группе вводили препара т
Циклофосфан -ЛЭНС внутрибрюшинно в дозе 125
мг/кг, контрольной группе (8 мыш ей) циклофосфан
не вводился. Мышей забивали 10, 20, 30 и 60 сутки
после введения препарата (по 5 мышей в каждой
группе).
Вся работа с лабораторными животными
проводилась в соответ ствии с п риказом МЗ РФ от
23 августа 2010 года №708н «Об утверждении
правил ла бораторной практики» и «Положением об
этическом отношении к лабораторным животным
ГНЦ «Института иммунологии» ФМБА России».
Эвтаназия мышей осуществлялась методом
цервикальной ди слокации шейных позвонков. У
мышей извлекали тимус и с елезенку. Клеточную
сусп ензию из органов готовили мягким
раздавливанием в стеклянном гомогенизаторе.
Количество клеток считали в камере Горяева,
предварительно окрасив суспензию красителем
генциановым ф иолетовым.
В настоящем исследовании определяли общее
содержание клеток, проце нт и абсолютное
содержание Т -лимфоцитов ( CD 3+) и их
субпопуляций (Т -хелперов, цитотоксических Т -
лимфоцитов), «возрастной» фенотип Т -клеток
(наивные Т -лимфоциты, центральные Т -кле тки
памяти) на проточном цитометре BD FACS Canto ™
II (BectonDickinson ) в стандартном режиме с
использованием моноклональных антител.
Моноклональные антитела фирмы
«eBioscience » (США) (препараты для
изотипических контролей той же фирмы)
использовали в след ующей комбинации:
1. Анти -CD 3-FITC + анти -CD 4-PerCP -Cy 5.5 +
анти -CD 8-APC -eFluor 780 + анти -CD 44 -PE -Cy 7 +
анти -СD62 L-PE (селезенка);
2. Анти -CD 3-FITC + анти -CD 4-PerCP -Cy 5.5
+анти -CD 8-APC -eFluor 780 + анти -CD 44 -PE -Cy 7 +
анти -CD 25 -APC (тимус).
Обработка резуль татов проводилас ь с
использованием компьютерной программы
Statistica 12.5 ( StatSoftInc ., США), где использовали
метод непараметрического анализа.
Исследованные данные представляли в виде Ме ( L-
H), где Ме – медиана, L – нижний квартиль, Н –
верхний квартиль . Для сравнения данных с
контролем приме няли непараметриче ский U-
критерий Манна -Уитни, при этом значимое
различие между группами считали статистически
значимым при p<0,05.
Результаты и обсуждение
При исследовании общей численности клеток
(рисунок 1, таблиц а 1) было показано, что
тимоциты более чувствительны к ток сическому
действию циклофосфана: на 10 сутки их
количество упало до 37 % от показателей
интактного контроля. Восстановление содержания
тимоцитов произошло к 20 суткам. Снижение
лимфоцитов селезенкип роисходило более
медленно: к 20 суткам их количество стало
достоверно ниже показателей интактных мышей,
достигнув 47 % от их уровня; восстановление
лимфоидных элементов селезенки произошло лишь
к 60 суткам после введения циклофосфана.
Национальная ассоциация ученых (НАУ) # 56, 20 20 7
7
Рисунок 1 - Динам ика изменения общ ей численности клеток тимуса и селезенки мышей линии C57 BL /6
после однократного введения циклофосфана (нормализованные относительно контроля данные).
*- обозначены достоверно различные значения
Таблица 1
Численность тимо цитов и лимфоцито в селезенки мышей линии C57 BL /6 после однократного
введения циклофосфана, млн
Сутки Тимоциты Спленоциты CD3 +CD4 +
Т-хелперы
CD3 +CD 8+
ЦТЛ
0 162,80
(142,30 -183,00)
127,88
(118,5 -139,5)
26,17
(23,93 -29,41)
24,9
(24,38 -26,26)
10 60,00*
(57 ,00 -66,00 )
100,50
(91,00 -100,5 0)
17,67
(14,39 -20,19)
13,39
(12,55 -13,58)*
20 165 ,00
(154 ,00 -172 ,00 )
60,5 0
(56,5 0-64,5 0)*
12,61
(12,17 -13,29)*
6,55
(6,16 -7,28)*
30 155 ,00
(155 ,00 -159 ,00 )
70,0 0
(62,5 0-71,25)*
16,34
(12,73 -17,66)*
6,14
(6,13 -6,6 0)*
60 152 ,00
(148,5 0-162 ,00 )
140,00
(110 ,00 -148,5 0)
27,37
(21,52 -27,39)
18,97
(13,58 -20,45)*
* – P <0,05 в сравнении с контролем (0 сутки)
Таким образом, можно констатировать, что
активно пролиферирующие тимоциты более
чувствительны к действию циклофосфанапо
сравнению с лимфоцитами селезенки. Отсрочка
восстановления спленоцитов, по -видимому,
связана с лимфопоэзом, идущим в центральных
органах иммунной системы.
Оценка восстановления периферических
Т-клеток была выполнена отдельно для Т-хелперов
(фенотип CD 3+4+) и цитотоксических
Т-лимфоцитов (ЦТЛ) (фенотип CD 3+8+) в
селезенке. После введения циклофосфа на
численность обеих субпопуляций стала постепенно
снижаться (таблица 1, рисунок 2): численность
ЦТЛ уже на 10 сутки снизилась до 54 % о т уровня
интактного контроля; численность Т -хелперов
достоверно снизилась только на 20 сутки,
достигнув 48 % от уровня и нтактного кон троля. С
30 суток, началось восстановление численности
обеих субпопуляций, которое полностью
завершилось для Т -хелперов на 60 сутки после
введения цитостатика, тогда как ЦТЛ к этому
времени не восстановили свою численность
полностью, достигнув только 76 % от уровня
интактного контроля. Можно констатировать, что
ЦТЛ являются более уязвимой популяцией при
назначении циклофосфана в терапевтических
дозировках по сравнению с Т -хелперами.
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
0 20 40 60 80
сутки
Тимус
Селезенка * * *
8 Национальная ассоциация учены х (НАУ) # 56, 20 20
Рисунок 2 – Динамика изменения численности основных популя ций лимфоцитов селезенки мышей линии
C57 BL /6 после однократного введения циклофосфана (нормализованные данные)
*- обозначены достоверно различные значения
Существенным механизмом поддержания и
восстановления численности периферических Т -
клеток является г омеостатическая пролиферация,
которая при значительном своем повышении в
условиях Т -лимфопении веде т к конверсии
фенотипа наивн ых Т -клеток. У мышей
«возрастной» фенотип принято оценивать по
коэкспрессии поверхностных маркеров – CD 44 и
CD 62 L. Наивные Т -клет ки имеют фенотип
CD 62 L+44 lo/-, а центральные Т -клетки памяти
CD 62 L+44 hi. Оценив их соотношение, можно
судить о вкладе тимопоэза и гомеостатической
пролиферации в процесс восстановления
популяций периферических Т -лимфоцитов.
Численность наивных Т -хелперов в нашем
эксперименте снижалась вп лоть до 20 суток,
численность центральных Т -клеток памяти до 30
суток (таблица 4).
Дальнейшее восстановление численности
«возрастных» субпопуляций Т -хелперов проходило
с явным преобладанием центральных Т -клеток
памяти, уров ень которых на 60 сутки после
введения препарата в 1,9 раза превышал уровень
интактного контроля, тогда как численность
наивных Т-хелперов не восстановилась к концу
эксперимента.
Таблица 4
Численность «возрастных» субпопуляций Т -хелперов (CD 4+) и ЦТЛ (CD 8+) мышей линии C57 BL /6
после однократного введения циклофосфана, млн
сутки CD4 +Tnaive CD4 +Tcm CD 8+Tnaive CD 8+Tcm
0 20,33
(16,27 -21,64)
0,79
(0,68 -0,96)
15, 45
(13,3 -16,1)
3,44
(3,24 -4,51)
10 8,77*
(7,18 -9,81)
0,79
(0,65 -0,94)
5,41*
(4,31 -5,59)
1,36*
(1,1 7-1,36)
20 5,81*
(5,18 -5,97)
0,43*
(0,38 -0,46)
3,94*
(3,85 -4,12)
0,94*
(0,92 -1,21)
30 8,87*
(7,7 -8,93)
0,4 0*
(0,4 -0,59)
3,40*
(3,35 -3,95)
1,07*
(0,64 -1,08)
60 13,94*
(9,1 -15,38)
1,51
(0,84 -1,59)
11,82*
(7,55 -12,01)
4,29
(3,18 -5,07)
* – P <0,05 в сравне нии с контролем (0 сутки)
Tcm – центральные клетки памяти, Tnaive – наивные Т -клетки
При анализе «возрастных» субпопуляций ЦТЛ
селезенки после введения циклофосфана тенденция
к преобладанию лимфоцитов с фенотипом
центральных Т -клеток памяти начинала
прос леживаться только в конце восстановления
численности обеих субпопуляций – в период с 30
по 60 сутки после назначения циклофосфана
(таблица 4).
Таким образом, анализ «возрастного»
фенотипа периферических Т -клеток указывает, по -
видимому, на существенный вкла д
гомеостатической пролиферации в восстановление
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
0 10 20 30 40 50 60 70
сутки
Т-хелперы
ЦТЛ
*
*
*
* *
*
Национальная ассоциация ученых (НАУ) # 56, 20 20 9
9
численности как Т -хелперов, так и ЦТЛ, с
усилением феномена конверсии фенотипа наивных
Т-клеток в центральные Т -клетки памяти и
относительным накоплением последних.
Подводя итог проведенному исследованию,
мо жно утверждать, что циклофосфан
преимущест венно поражает быстро делящиеся
популяции тимоцитов. Восс тановление
Т-клеточного звена иммунной системы начинается
с центральных лимфоидных органов –
нормализации тимопоэза. Однако уровень
повреждения периферически х Т -клеток
оказывается настолько глубоким, что
восстановившийся к 20 суткам тимопоэз не
способен ко мпенсировать дефицит Т -клеточных
популяций как минимум в течение 60 суток после
введения циклофосфана. Сохраняющийся дефицит
периферических Т -лимфоцитов веде т к усилению
конверсии фенотипа наивных Т -клеток и
накоплению Т -хелперов и ЦТЛ с фенотипо м
централь ных Т -клеток памяти. Клональная
экспансия периферических Т -клеток ведет к
сужению репертуара Т -клеточных рецепторов,
возможному накоплению аутоагрессивных кл онов
и преждевременному старению иммунной системы,
что необходимо учитывать при назначении
циклофос фана в терапевтических целях.
Список литературы:
1. Баторов Е.В. Влияние мезенхимальных
стромальных клеток на иммунную реконституцию
в посттрансплантационном п ериоде у больных
лимфомами. Новосибирск, 2013. – 134 с.
2. Зассеева М.Д. Изменения гистологической
структуры тимуса мыши и митотической
активности тимо цитов в ходе акцидентальной
трансформации и иммунного ответа. Санкт -
Петербург, 2015. – 124 с.
3. Ильичев А.В. , Лебединска я Е.А., Фадеева
Е.В., Лебединская О.В., Ахматова Н.К.,
Четвертных В.А., Годовалов А.П., Мелехин С.В.,
Киселевский М.В., Мальдов Д.Г.. Дей ствие
стимфорте на мононуклеарные лейкоциты и
лимфоидные, органы мышей на фоне введения
циклофосфана. // Ме дицинская иммунология. –
2011. – T. 13 (2). –133 -138 C.
4. Телегин Л. Ю. Фармакогенетика
циклофосфамида. — М.: ИНФРА -М, 2012. – 81 с.
5. Ярилин А.А. Иммуно логия: учебник / А.А.
Ярилин. М.: ГЭОТАР -Медиа, 2010. - 752 с.
6. Yoon T.D., Lee H.W., Kim Y.S., et al.
Identi fication and analysis of expressed genes using a
cDNA library from rat thymus during regeneration
following cyclophosphamide -induced T cell depletion
// Int J Mol Med. - 2013. – Voi. 31(3). – P. 731 -739.